在CAR-NK细胞治疗中克服肿瘤耐药机制

在过去十年中，自体CAR-T疗法彻底改变了血液肿瘤的治疗模式。目前，全球已有8种不同的CAR-T疗法获得市场授权，用于治疗多发性骨髓瘤（MM）和CD19+B细胞恶性肿瘤。然而，尽管CAR-T在复发和难治性血液瘤中取得了临床成功，但仍然面对着一些挑战，如繁琐高昂的制造成本和高毒性，以及许多患者的复发及耐药。

随之孕育而生的是CAR-NK细胞免疫疗法，作为一种更安全、更快、成本效益更高的方法出现，没有CAR-T细胞的严重毒性迹象。由于NK细胞独特的生物学特性和多种作用机制，使CAR-NK细胞治疗成为强有力的临床候选。

大量的CAR-NK临床前研究已被证明在癌症治疗中有效，尤其是在血液系统恶性肿瘤的治疗中。到目前为止，有31项临床试验探索了11种不同的CAR靶点，包括CD19、CD20、CD22、NKG2D、CD33和BCMA等。在慢性淋巴细胞白血病（CLL）和难治性和复发性淋巴瘤（NCT03056339）中，双顺反子CD19-CD28-ζCAR/IL-15 UCB NK细胞获得了令人印象深刻的反应（ORR:73%; CR:64%）。

尽管有多种优势，CAR-NK治疗仍需面对许多挑战，这些挑战可能会引发耐药性并影响其疗效。因此，我们需要关注这些机制，特别是导致血液肿瘤逃避免疫监测的CAR-NK功能障碍，从而制定有效策略克服CAR-NK功能衰竭和迁移障碍，保证CAR-NK效应的持久性。

制造条件：CAR-NK治疗效果的关键因素

过继细胞治疗的主要问题之一是需要大量具有潜在增殖能力的增强功能效应细胞，以获得最佳临床反应。因此，优化来源、细胞因子启动和扩增方案可以保证CAR-NK细胞的细胞毒性和体内持久性。

细胞因子启动和扩增

用作开发CAR-NK治疗平台的最常见来源包括来自PB或UCB的NK细胞、NK细胞系（如NK92）和来自IPSC、HESC或CD34+造血干细胞的干细胞衍生NK细胞。

关于NK细胞启动和扩增策略，大多数基于可溶性细胞因子和人工抗原呈递细胞（aAPC）与膜结合分子（如细胞因子和/或共刺激配体）的使用。常见的γ链细胞因子IL-2、IL-7、IL-15和IL-21，以及其他如IL-12或IL-18，单独或联合使用。如使用经基因修饰以表达膜结合IL-15或IL-21和4-1BBL的饲养细胞可大大提高扩增倍率，同时保持NK和CAR-NK细胞的细胞毒性潜能。

此外，由于细胞因子自身的系统给药可能产生不期望的效果，最新的工程方法侧重于原位递送和利用细胞因子信号，以延长NK/CAR-NK细胞的持续性，同时保持其优化的功能。例如，一种分泌IL-15的CD19 CAR-UCB-NK细胞，该细胞在体外显示出增强的细胞毒性，并在I/II期临床试验中显示了CAR-NK的持续性，而患者体内没有系统性IL-15水平升高（NCT03579927）。

自杀倾向降低NK细胞功效

NK细胞体外扩增可能导致一种“自杀”的不良现象，细胞识别其它同类细胞表面的受体或配体，并触发针对它们的细胞毒性活性。在NK或CAR-NK细胞扩增过程中，有几种机制可能导致自相残杀。

其中，众所周知的Fas/FasL轴是最相关的机制之一。FasL介导的细胞毒性在NK细胞功能中起关键作用，因为当其与靶细胞中的受体Fas结合时，它触发caspase依赖性凋亡。Fas也可以作为抑制NK细胞活性的稳态机制由NK细胞表达，称为活化诱导细胞死亡（AICD）。据报道，其表达在NK细胞扩增过程中可能异常增加，特别是在IL-2、IL-15后或特定饲养细胞如K562-mIL21存在下培养时，导致自相残杀。

另一种可能导致NK细胞间自相残杀的受体是NKG2D。NKG2D是一种天然受体，主要由NK、CD8+T和γδT细胞表达，识别多种应激诱导配体。有越来越多的数据描述活化的NK细胞有NKG2D-L表达，但其来源和对NK细胞功能的影响仍有争议。

在CAR-NK细胞中，由于CAR配体/抗原识别，也可能出现自相残杀。例如CD38 CAR-NK细胞，因为NK细胞自然表达CD38，并且在存在IL-2或工程饲养细胞的情况下，其表达可在体外扩增期间上调。因此，NK细胞可能被抗CD38 CAR识别而破坏。

T细胞同种异体排斥反应

宿主免疫系统对供体NK细胞的识别和排斥可能潜在地减少同种异体CAR-NK细胞在临床环境中的持续性。负责这些机制的主要效应器是同种异体反应性T细胞，其识别同种异体NK细胞上的非自身HLA分子。

去淋巴化疗诱导宿主免疫系统的短暂降低，从而改善过继细胞植入。除了减少T细胞和NK细胞外，淋巴细胞减少药物还减少了具有免疫抑制特性的细胞群，如Treg和骨髓源性抑制细胞（MDSC），为过继性细胞扩增创造了更有利的微环境。

目前，正在开发其他策略以防止宿主系统排斥。如在人类PB-NK细胞中，通过靶向β-2-微球蛋白基因（β2M）来破坏HLA I类表达，以规避CD8+T细胞同种异体反应性。

克服衰老：增强CAR-NK免疫疗效  

在缺乏细胞因子支持的情况下，NK细胞的体内寿命较短，降低了非肿瘤靶向毒性和致瘤风险，但也缩小了治疗窗口。过继转移后NK细胞的体内持久性和增殖已显示与临床反应相关。因此，由于CAR-NK细胞的体内低持续性可能导致早期复发。此外，短的寿命也限制了NK细胞在制造过程中的体外增殖和扩增，使其难以获得足够的细胞数量，并缩短了通过基因工程优化NK细胞的时间。因此，延长寿命可以提高CAR-NK细胞的功效。

与可以持续数月乃至数年的T细胞不同，人类NK的寿命没有明确定义，在不同亚群之间存在差异，并且可以在体外进行操纵。在体内，成熟NK细胞需要持续的细胞因子支持，没有这种支持，它们在循环中只能维持1-2周。当CAR-NK被工程化以表达IL-15时最高存活可达68天。然而，尽管允许通过外源性细胞因子或HLA匹配来改变寿命，但NK和CAR-NK是受衰老影响的短命细胞，衰老不可避免地在体外产生，不会在患者体内持续很久。

细胞衰老与增殖能力的丧失和功能缺陷有关，其特征是端粒缩短、基因组DNA双链断裂的检测、修复机制的激活以及细胞周期的停止。在参与NK细胞寿命控制的因素中，端粒长度至关重要。对于过继性NK细胞治疗，端粒长度取决于NK来源或选择的活化/扩增方法。例如，iPSC衍生的NK细胞的端粒长度比从PB扩增的细胞长得多。此外，IL-2、IL-15和IL-21都已被证明能上调NK细胞中的端粒酶活性，从而防止端粒丢失并允许细胞延长复制。通过基因工程异位表达hTERT可能是提高CAR-NK细胞持续性的有效策略，从而提高其治疗潜力，其中端粒长度和复制能力的维持与抗肿瘤效率相关。

肿瘤微环境：限制CAR-NK治疗效果的绊脚石  

NK细胞在肿瘤微环境中可被诱导为可逆的耗竭状态，其特征是效应器功能受损、表型改变以及肿瘤相关免疫检查点的表达上调。除此之外，患者的NK细胞和输注的CAR-NK细胞在肿瘤生态位中还会受到免疫抑制细胞和可溶性细胞因子产生的不利环境，从而抑制NK细胞。

耗竭相关免疫检查点

一些研究表明，扩增的NK细胞增加PD-1的表达，并且NK细胞产生的IFN-γ在肺癌小鼠模型中增加PD-L1的表达。目前正在研究将PD-L1 CAR-NK细胞与pembrolizumab和N-803联合用于胃癌和头颈癌的II期临床试验（NCT04847466）。

与NKG2A类似，NK细胞体外扩增可上调其他耗竭受体的表达，如TIM-3和TIGIT。在临床前研究中阻断TIM-3或TIGIT可提高NK细胞对实体和血液系统恶性肿瘤的细胞毒性效力，目前正在多个临床试验中测试抑制性抗体（如NCT04623216、NCT03489343、NCT04150965、NCT04354246和NCT05289492）。此外，与T细胞不同，NK细胞中其他受体如LAG-3或CTLA-4的表达水平和抑制相关性仍不清楚。

总之，并非所有免疫检查点在体外扩增的NK细胞中以相同的水平诱导，它们在调节NK细胞抗肿瘤活性方面也没有类似的相关性。激活和抑制信号的平衡调节NK细胞功能，因此，需要更多的努力来评估存在CAR刺激时每个免疫检查点表达的影响，以指导改善CAR-NK治疗的策略。

TME中的其它抑制因素

来自TME的可溶性因子可能增强NK细胞抑制，如通过蛋白水解脱落产生的可溶性NKG2D-L（sNKG2D-1）会降低NKG2D的表达，减弱NK细胞的抗肿瘤效力。设计用于识别相同MICA/B结构域的CAR已在iPSC衍生的NK细胞中显示出抗白血病的功效。

此外，大多数癌症的TME中存在其它的可溶性因子，如白细胞介素、酶和代谢物，影响NK细胞的有效性。其中大部分不仅由肿瘤细胞释放，而且由共存于肿瘤生态位中的免疫抑制细胞释放。血液肿瘤中广泛存在着高浓度的其他抑制性细胞因子，如IL-6、IL-10和TGF-β。已有研究通过在工程化NK细胞中敲低TGF-α受体表达或加入小分子受体激酶抑制剂来增强CAR-NK细胞治疗。

除了可溶性因子，TME中还存在的免疫抑制细胞通过直接接触或释放可溶性因子促进肿瘤增殖，同时降低NK细胞功能。例如Treg、Breg、MDSC和肿瘤相关巨噬细胞（TAM），主要是M2表型。缺氧和代谢因素，如营养缺乏和酸度，也会产生不利的微环境，损害NK细胞的抗肿瘤活性。

趋化性：影响NK细胞的迁移和归巢  

CAR-NK免疫治疗的挑战之一在于到达BM和LNs的有限转运和归巢能力。临床研究表明，改善过继输注NK细胞进入骨髓的情况与更好地控制AML患者的疾病有关。目前正在临床前模型中探索维持和/或增强CAR-NK细胞中趋化因子或粘附受体表达的多种策略，以改善其迁移和归巢。

CXCR4、CXCR3、CCR3、CCR5和CX3CR1是NK群体表达的主要趋化因子受体，它们有助于响应TME中存在的趋化因子。考虑到血液恶性肿瘤TME中发现的高水平趋化因子，对过继转移NK细胞中趋化因子受体的表达修饰似乎是一种有利的策略。UCB衍生NK细胞中CXCR4表达水平高于PB-NK细胞，表明BM归巢能力更好。通过双顺反子慢病毒转导修饰过表达CXCR4的CD19-CAR-NK细胞与huCAR19 NK细胞相比，向CD19+肿瘤细胞的迁移增加了两倍以上。

除了调节趋化因子受体表达的策略外，还可以通过促进NK细胞与E-选择素等粘附分子的相互作用来增强BM归巢。例如，用人岩藻糖基转移酶6（FUT6）和GDP岩藻糖处理NK-92MI细胞产生细胞表面E-选择素配体sialyl Lewis X（sLeX），以改善向BM的迁移并增加对B淋巴瘤细胞的杀伤。

基因编辑：设计CAR-NK 2.0  

基因编辑的应用为提高NK细胞的效率和持久性带来了巨大希望。为此，不同的研究侧重于识别负调节因子，其可通过增加细胞毒性、改善代谢和体内持久性，或通过克服抑制性免疫检查点和TME触发的功能耗竭机制，调节免疫功能并增强NK和CAR-NK效力。

提高CAR-NK持续性的主要策略之一是针对抑制性免疫检查点，如PD-1/PD-L1轴，事实上，NK细胞中的PD-1敲除增加了卵巢癌异种移植模型中的抗肿瘤活性。TIM-3是NK细胞表达的另一个检查点受体，TIM-3敲除的NK细胞在体外改善了细胞毒性。类似的基于CRISPR/Cas9的策略已应用于Siglec-7受体，当其与肿瘤细胞上表达的某些唾液酸化聚糖结合时，触发NK抑制。

为了避免NK细胞耗竭，靶向细胞因子相关的免疫检查点是另一种有趣的方法。包括细胞因子信号抑制剂（SOCS1–7和CIS）在内的几种蛋白质通过NK细胞中的JAK/STAT途径下调细胞因子信号，它们的中断可增加NK细胞的活性和持续性。来自不同的研究表明，NK细胞中CISH的敲除增加了它们的细胞毒性特性，甚至改善了它们的代谢适应度。

CAR治疗的最大挑战之一，尤其是在实体瘤中，是肿瘤周围产生的免疫抑制微环境。几个研究小组已经成功地编辑了NK细胞，以破坏NK和CAR-NK细胞中的TGFβ-R2，这使得它们在体外对TGF-β抑制具有抗性，因此增强了对肿瘤的肿瘤控制。

消除CAR-NK细胞中的CAR靶向受体对于开发有效的免疫治疗产品至关重要。例如，CD70在NK细胞中上调，导致自相残杀。通过使用CRISPR/Cas9消除NK细胞中的CD70，获得了抗自杀倾向的细胞，而不影响其细胞毒性效力。按照类似的策略，已经证明CD38-CAR-NK细胞中敲除CD38会导致自相残杀导致的细胞死亡减少，并且CAR-NK细胞对AML原代细胞的细胞毒性反应更强。

最后，基因编辑可用于调节NK细胞迁移。已经表明，使用基因编辑破坏CCR5改变了体内NK细胞迁移，这减少了向肝脏的转运并增加了BM归巢。这种方法有望重新引导CAR-NK细胞，并提高其抗肿瘤的效力。类似的策略还可用于靶向CAR-NK表面的其他趋化因子受体，并将其重定向至肿瘤部位。

小结  

NK细胞免疫生物学领域的进展和进步为更好和更新颖的免疫疗法奠定了基础，NK细胞优秀的抗肿瘤作用使其成为细胞免疫治疗的焦点。CAR-NK细胞疗法是一个很有前途的临床研究领域，与CAR-T细胞相比，CAR-NK细胞具有自己独特的优点，但仍面临着一些挑战。这些挑战包括细胞的持久性，克服免疫抑制微环境，以及肿瘤归巢等。相信解决好这些问题，基于NK细胞优秀的抗肿瘤血统，极有可能在CAR修饰的武装下为肿瘤治疗带来新的突破。